明星载体AAV：当前的挑战与解决方案
The following article is from 智银医药 Author 智银
AAV作为基因治疗的明星载体，由于较高的组织特异性、安全性以及长时间表达等优势，目前已经被广泛地应用于体内目的基因的操作。但是，AAV仍面临着转导效率低、组织特异性有待提高、高免疫原性、基因递送容量有限等诸多挑战。本文将重点介绍AAV的当前面临的挑战以及潜在的解决方案。
开发新的AAV血清型
现有AAV血清型的临床应用受到低转导效率和组织特异性、高免疫原性以及专利保护的限制，因此开发新的AAV血清型对于大多数基于AAV的基因治疗至关重要。
★ 低转导效率：由于较低的转导效率，导致了AAV递送相关基因时需要注射较高的剂量，增加安全性风险的同时，也造成了成本的提升；
★ 低组织特异性：传统的AAV载体组织特异性较低，导致基因转导的效率低，同时非特异性感染增加了安全性风险;
★ 高免疫源性：大约50 - 90%的人群(取决于血清型)保有一定的抗AAV抗体水平，预先存在的AAV抗体或对初始剂量的AAV基因治疗的免疫反应触发，直接限制了基因治疗的可治疗患者群体；
★ 专利保护：已经有10多种野生型的AAV被国外企业用专利保护起来了;
AAV新血清型的开发方法包括天然发现、合理设计、定向进化和计算机发现（in silico discovery）策略。
★ 天然发现：目前被广泛使用的AAV2是在被污染的细胞中发现的，而其他亚型的AAV几乎都是自然界中筛选出来的，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9都可以在人体中发现；
★ 理性设计：对衣壳蛋白进行基因工程的改造，主要有两个方法，一是在衣壳蛋白上加一段多肽可以跟细胞膜表面的一些受体结合从而提高组织特异性，二是利用单链抗体片段（scFv）或 DARPin（锚蛋白重复蛋白）来改造，难点会在于如何不影响三种衣壳蛋白的组装且正确的分布在衣壳外部；
★ 定向进化：定向进化的基础是模拟自然进化，在这种情况下，衣壳受到选择性压力，产生具有特定生物学特性和有利特性的遗传变异。进一步的版本是随机突变（error-prone PCR）产生文库用于筛选。构建多样化的AAV衣壳文库的方法主要有基因改组生成嵌合衣壳、易错PCR、特定位点插入随机多肽片段、衣壳表面高变成环区域的随机替换；
★ 计算机发现（in silico discovery）：随着生物信息学和计算机算力的提高，体外模拟突变体造成的蛋白二级、三级折叠至四级组装以寻找新型AAV变体。
优化AAV基因表达载体
除了开发新的血清型来提升AAV的组织特异性以及基因整体表达效率外，优化AAV的基因表达载体也是一个很好的备选方案。比如通过启动子的优化可以实现基因的表达的高效性以及组织特异性。
提升AAV递送的基因容量
AAV是单链DNA病毒，基因组结构简单，全长约 4.7kb。除去两端的反向末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）、启动子以及终止子，可以递送的目的基因长度约为4.5kb。与目前依旧热门的基因治疗载体例如腺病毒（外源基因容量~37kb），逆转录病毒（外源基因容量<8kb）或者慢病毒（外源基因容量<5kb）相比，AAV的基因递送容量实在是太小。
二元载体系统是未来重要的发展方向之一。在二元AAV载体系统当中，巨大的外源基因被分割成两段并被包装到不同的AAV颗粒内。通过对同一细胞的共转化，外源基因片段可以在目标细胞内重新组装、转录以及表达。在理想的情况下，二元的AAV载体系统可以将外源基因承载容量扩充到9kb。基于不同的组装原理，二元的AAV载体系统又可以细分为以下几种类型：
★ 重叠式二元AAV载体；
★ 反式剪接二元AAV载体；
★ 混合式二元AAV载体；
★ 转录后剪接的二元AAV载体；
★ 依赖于连续同源重组的二元AAV载体；
AAV上游生产的规模化
AAV的通常采用经典的三质粒共转染法（Helper-free AAV包装系统）。首先构建并纯化获得三个细菌质粒VEC,CAP和REP，其中VEC携带插入的基因，CAP和REP为构建AAV组成部分。将三个质粒共转染合适的细胞株，就能在细胞裂解液中得到携带目的基因的rAAV。由于是基于贴壁细胞基础上的生产，细胞扩大化生产会有较大困难。另外这种制备方法需要制备大量高质量的载体质粒，rAAV的产量在很大程度上取决于转染的效率。
为了更好的实现规模化生产，发展出了以下3种AAV生产工艺：3D贴壁培养、悬浮细胞培养、杆状病毒生产。
★ 3D贴壁培养：微载体提供了极大的培养表面积/体积比，提供了高的细胞产量而无需凭借大容量的设备；同时还可以减少劳动力需求，降低污染风险。缺点是实现高效转染有挑战；
★ 悬浮细胞培养：首先需要建立起含有rAAV的Rep/Cap基因或ITR基因组的稳定细胞株（常用Hela细胞），再用辅助病毒来感染生产出rAAV。此方法的优点是所用细胞可选能作悬浮培养的工业化生产细胞株，适合临床规模生产。缺点是稳定细胞株的建立与鉴定需要很长时间；细胞株需要注意多次传代后的稳定性；后续纯化过程中要注意完全失活辅助病毒；
★ 杆状病毒生产：用杆状病毒Baculovirus携带Rep/Cap基因及ITR基因组，去感染悬浮培养的SF9昆虫细胞，可以包装出rAAV。该方法的应用目前也较为广泛，上市药物Glybera就是用的这种方法。优点是易扩大、产量高、无血清、无需质量大规模转染、成本相对较低，缺点是需要构建Bacmid表达载体，以及下游纯化工艺需要去除杆状病毒。
降低AAV 空壳率
空壳AAV是一类不携带目的基因的AAV载体，通常是由生产过程中的病毒包装不完全所产生。基因治疗产品纯化过程中必须将其最小化，因为这些病毒衣壳不包含DNA，当将它们输注给患者时，一方面会竞争细胞表面有限的受体数量；另一方面对基因治疗无益处，还有可能引起副反应。
目前的解决策略包括优化下游工艺实现规模化去除空壳AAV以及优化上游工艺较少空壳AAV的产生。
★ 优化下游纯化工艺：AAV纯化的历史方法包括离心和氯化铯等密度梯度离心，另外为避免铯的重金属毒性，已开始替代使用碘克沙醇。等密度梯度离心的优势是可以从空颗粒中分离完整衣壳，缺点是不适合用于商业化的GMP生产，因其可放大性受限。比较适合规模化的技术路线是色谱柱纯化（亲和层析+离子交换层析）。亲和层析能够纯化出高纯度的AAV，但无法分离病毒空壳和完整病毒。由于空壳和完整病毒的等电点存在微小差异，因此通过高分辨率阴离子交换树脂可以有效地分离空和完整病毒；
声明：本文旨在知识共享，所有内容仅学术交流研究，不构成任何建议。